Metody in vitro a in vivo pro stanovení kvality dietní vlákniny
Summary
The health effects of dietary fibre in civilisation disease prevention are predominantly dependent on soluble fibre fermentation and the amount of insoluble fibre. The article reviews available methods for nutritional quality assessment of dietary fibre in vivo and in vitro. A suitable and non-invasive methodological approach is the determination of hydrogen and methane concentration in expired breath.
Key words: dietary fibre, anaerobic fermentation, breath tests
Úvod
Vláknina a její účinky na lidský organizmus jsou předmětem zájmu již po delší dobu. Nutriční kvalita vlákniny závisí na fermentaci rozpustné vlákniny v tlustém střevě, což ovlivňuje typ a množství podané vlákniny a především i bakteriální osídlení střeva. Vlivy rozpustné – fermentabilní a nerozpustné – nefermentabilní vlákniny se vzájemně doplňují. Anaerobní fermentací v tlustém střevě vznikají jednoduché látky plynného charakteru, především vodík a metan, které lze stanovit ve vydechovaném vzduchu.
Obsah vlákniny je stanovován převážně gravimetrickými, enzymatickými, kolorimetrickými nebo popřípadě chromatografickými metodami (Knudsen, 2001). Enzymaticko-gravimetrické metody stanovení částečně simulují degradaci v gastrointestinálním traktu za použití enzymů α-amylázy, amyloglukosidázy a proteinázy (Šejblová, 1993; Tichá, 2003).
Anaerobní biologické procesy zahrnují děje směřující ke snížení obsahu organických látek, které se biologicky rozkládají v anaerobním prostředí. Mikroflóra tlustého střeva je zastoupena z 99,9 % bakteriemi anaerobními. Dietní vláknina, která dosáhne tlustého střeva, podléhá fermentaci bakteriální flórou a vznikají SFCA, CO2, H2, CH4. Organické látky jsou degradovány pomocí aerobních a anaerobních biochemických procesů. Proces zahrnuje několik fází (obrázek č. 1). Nejprve nastává hydrolýza na jednoduché sloučeniny, kterými jsou monosacharidy, organické kyseliny atd. Následuje přeměna organických monomerů za pomocí acidogenních bakterií (Bacteroides, Clostridium, Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterobacter) (Fernandes, 2000). Další fází je pak autogeneze, kdy pomocí bakterií Syntrophobacter či Syntrophomonas vznikají vodík, oxid uhličitý a kyselina octová (Boone, 1985). Závěrečným krokem je metanogeneze, kdy probíhá metanizace kyseliny octové acetotrofními metanogenními bakteriemi:
CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O;
z rovnice vyplývá, že dochází k výrazné redukci objemu plynů v lumen střeva (Tichá, 2003).
Metodiky nutričního hodnocení vláknin
Stanovení fermentace dietní vlákniny in vitro
Principem této metody je fermentace vzorku vlákniny v roztoku pufru pomocí inokula (např. bakterií obsažených v exkrementech laboratorního potkana) a kvantitativní změření produkce vznikajícího plynu. Experiment je koncipován vždy v porovnání s vlákninou fermentabilní, tj. pektinem, a nefermentabilní, tj. celulózou. Rovněž je stanovováno pH před zahájením a po ukončení experimentu, vzhledem k tomu, že snížení pH v tlustém střevě je prospěšné pro zvýšení absorpce minerálních látek (hořčík, vápník či železo), zamezení putrefakčním procesům a ovlivnění produkce butyrátu s ohledem na její energetický vliv na epitel sliznice kolon. K provedení fermentace in vitro jsou potřeba stopové prvky a pufry. Vodný roztok stopových prvků obsahuje železnaté, manganaté, zinečnaté, kobaltnaté, nikelnaté, měďnaté a molybdenanové kationty ve formě síranů či chloridů. Roztok pufrů obsahuje bikarbonát a hydrogenuhličitan sodný, dále pak chlorid sodný a draselný a močovinu. Výsledné pH roztoku pro fermentaci je 7,8. Do roztoků se přidá testovaná vláknina (400 ml roztoku stopových prvků a pufru s 800 mg vlákniny). Probubláváním oxidem uhličitým se pH upraví na 6,8. Přidá se inokulum a při teplotě 37 ˚C se měří vznikající plyn nad hladinou nasyceného roztoku NaCl v 500ml odměrném válci v definovaných intervalech (Zadák, 2010; Rummney, 1992). Výsledek pro pektin, celulózu a doplněk stravy (komerční vlákninu) je uveden v tabulkách č. 1 a 2 a na obrázku č. 2.
Dechové testy
V dechu člověka je přítomna, kromě původních složek vzduchu, i řada těkavých látek exogenního (ze stravy či vdechnutím z okolního prostředí) a endogenního, především metabolického původu. Prokázání přítomnosti či kvantifikace těchto látek může přinést řadu cenných informací. Monitoring některých látek například umožní sledovat metabolické procesy v lidském organizmu, a zjistit tak informace o možnostech jejich ovlivnění či stanovení metabolických poruch. Produkty metabolických procesů jsou však přítomny ve velmi nízkých koncentracích a základním problémem odběru vydechovaného vzduchu je fakt, že v dýchacích cestách, především v bronchiolách, je vzduch obměňován difuzí v koncentračním spádu. Je třeba tedy počítat při odběru vydechovaného vzduchu s tzv. mrtvým prostorem dýchacích cest. Způsob odběru vydechovaného vzduchu má kruciální význam na kvantifikaci látek v dechu. Způsob odběru vydechovaného vzduchu je praktikován buď otevřeným systémem, kdy je vdechován běžný vzduch z okolí a výdechy jsou shromažďovány slámkou do zkumavek (např. detekce Helicobacter pylori – s 13C močovinou) (Kocna, 2006), nebo tzv. uzavřeným systémem. Uzavřený systém je založen na vdechování vzduchu (prostého bez stanovovaných látek) přes dýchací masku či náustek a vydechovaný vzduch je jímán do sběrného vaku či speciálně zkonstruovaného plynojemu (obrázek č. 3). Vlastní analýzy se pak provádí metodou elektrochemickou, či detekcí hmotnostním spektrometrem atd. Interpretace výsledků z dechových testů je pak obtížnější než u hodnot z krve, kdy objem krve je udržován konstantně. Objem vydechovaného vzduchu se mění v závislosti na mnoha podmínkách (fyziologická aktivita, stres atd.) a těkavé látky mají krátký biologický poločas a reagují velmi rychle na aktuální změny v organizmu. Hlavní výhodou vyšetřování dechovým testem je jeho neinvazivita. Nevýhodou pak aplikační potenciál a omezené možnosti kvantifikace (Gasparič, 2004). Dechové testy jsou v současné době stále více uplatňovány ve funkční diagnostice (jako diagnostický doplněk v gastroenterologii), mnoha klinických aplikacích a výzkumech.
Minoritními látkami ve vydechovaném vzduchu jsou například oxid dusnatý, vypovídající o napětí hladké svaloviny v dýchacích cestách, nebo oxid uhelnatý, pocházející degradací tetrapyrollového kruhu z hemoglobinu. Dále lze v dechu identifikovat další těkavé organické látky, které vznikají v organizmu, například metan nebo vodík z rozkladu reziduálních částí stravy v tlustém střevě. Vláknina je degradována mikroorganizmy tlustého střeva. Této biologické přeměně podléhá cca 70 % polysacharidů vlákniny. Využitelnost je odlišná od typu vlákniny, např. pektin 65–97 %, guarová guma 76 %. Konečnými produkty metabolizace jsou, kromě plynů, využitelné nižší mastné kyseliny, čímž se získá energie kolem 3 kJ.g-1 sacharidu, oproti 17 kJ.g-1u škrobu (Segal, 1988). Plynné produkty anaerobní fermentace v živém organizmu jsou částečně vylučovány do vydechovaného vzduchu.
Metan ve vydechovaném vzduchu
Stanovení metanu ve vydechovaném vzduchu lze aplikovat i v klinické praxi, kdy vysoké koncentrace metanu bývají příčinou syndromu slepé kličky, či nekrotizující enterokolitidy, tj. bakteriální invaze do tenkého střeva, dále pak nárůst metanu v dechu provází malabsorpce (syndrom krátkého střeva, laktázová deficience, apod.) (McKay, 1985; Tichá, 2003). Metan je v tlustém střevě produkován v závislosti na osídlení střeva metanogenními bakteriemi (> 108 metanogenních bakterií / 1 g suché stolice, tj. především Metanobrevibacter Smithii) a na dietních zvyklostech (Fernandes, 2000). Metan není produkován u novorozenců a dětí, výskyt produkce roste s věkem. V naší populaci je 40–70 % jedinců (tzv. metanoproducentů), kteří jsou schopni tvořit metan v tlustém střevě. Metan v dechu je stanovován pomocí analyzátorů (např. MicroFID, Photovac, Perkin Elmer – obrázek č. 4, atd.) nebo separační metodou plynové chromatografie s plamenoionizační detekcí (Tichá, 2003).
Stanovení metanu v dechu lze využít rovněž k definování transit time (tj. dobu průchodu potravy gastrointestinálním traktem) pro daného člověka a jeho schopnosti využít dietní vlákninu. Metodika určení transit time spočívá ve stanovení bazální koncentrace metanu v dechu, v aplikaci testované vlákniny a v monitoringu koncentrace metanu v dechu po dobu 3–4 hodin. Velikost vzniklého píku nárůstu koncentrace metanu v dechu naznačuje podíl fermentovatelnosti vlákniny ve střevě. Plocha pod píkem může být použita jako jedno z kritérií při hodnocení fermentovatelnosti dietní vlákniny in vivo. Jako srovnávací vláknina pro porovnání ostatních typů vláknin je často užívána lékopisná vláknina laktulóza (Tichá, 2003). Na obrázku č. 5 je uveden transit time pro 2 pacienty po aplikaci 20 g laktulózy. Produkce metanu je definována množstvím produkce plynů ve střevě, tj. anaerobní fermentací v tlustém střevě, a tím i nutriční kvalitou podané dietní vlákniny pro daného pacienta.
Dietní vláknina je rovněž známa svým snižujícím vlivem na koncentraci žlučových kyselin, z čehož vyplývá, že žlučové kyseliny inhibují metanogenezi. Nárůst příjmu dietní vlákniny u metanoproducentů podporuje metanogenezi i nižší koncentraci žlučových kyselin (Fernandes, 2000).
Vodík ve vydechovaném vzduchu
Významným regulačním faktorem anaerobního procesu je vodík, který je důležitým produktem fermentace již v počátečních stadiích rozkladu. Reguluje skladbu kyselin produkovaných ve fázi acidogeneze a jejich rozklad ve fázi acetogeneze (Ermler, 1997). Z přijímané potravy odolá digesci a absorpci 10–20 % oligo- a polysacharidů (Levitt, 1987). Při fermentačních experimentech bylo zjištěno, že vodík je produkován fermentací glukózy v množství 80 mmol/g. Při hladovění produkce vodíku klesá k velmi nízkým koncentracím (Hammer, 1993). Výše uvedený průběh fermentace v lidském tlustém střevě může účinně probíhat pouze za nízkého parciálního tlaku vodíku. Vyšší parciální tlak vodíku by účinně inhiboval acidogenní a acetogenní fázi fermentace. Vodík je proto průběžně metabolizován tzv. hydrogenotrofními mikroorganizmy. Mezi tyto organizmy patří reduktivní acetogeny, metanogenní archebakterie (viz výše) a sulfát redukující bakterie. Reduktivní acetogeny jsou zodpovědné za metabolizaci největšího podílu vznikajícího vodíku. Tyto bakterie syntetizují acetát z oxidu uhličitého a vodíku. Do této skupiny jsou zařazovány bakterie z rodu Ruminococcus, Clostridium a Streptococcus (Dore, 1995). Z výše uvedeného vyplývá, že zásadní vliv na produkci vodíku v tlustém střevě má podíl vlákniny v dietě. Bakteriální fermentací může být metabolizováno až 75 % přijaté dietní vlákniny. Suplementace dietní vlákninou je tak nejfyziologičtější cestou zvýšení produkce vodíku v lidském organizmu. Vodík, který vzniká fermentací v tlustém střevě a není dále bakteriemi spotřebován, může být eliminován flatulencí nebo exspirací. Na chemickém složení střevních plynů se velmi výrazně podílí fyziologie hostitelského organizmu. Většina oxidu uhličitého, kolem 30–40 % vodíku a stejný podíl metanu, jsou absorbovány hostitelským organizmem a zbylá část vodíku je částečně bakteriálně metabolizována nebo s ostatními plyny vyloučena flatulencí (Christl, 1992). Množství vylučovaných střevních plynů bylo zkoumáno fyziology už v 19. století (Ruge, 1861). Následující studie se shodly na průměrném množství vylučovaných střevních plynů 350–650 ml/den (Steggerda, 1968), z čehož 7 % představuje metan a 20 % plynný vodík. Zároveň byl zaznamenán vliv dietní vlákniny na množství vylučovaného střevního plynu, kdy aplikace luštěnin, jako dominantního podílu diety, zvýšilo množství vylučovaného střevního plynu na 4,2 l/den. Po aplikaci laktulózy lačnícím dobrovolníkům s minimální produkcí střevních plynů bazálně byla zaznamenána produkce 50–200 ml/6 hod po požití 12,5 g laktulózy. I když to zdánlivě odporuje zdravému rozumu, exkrece vodíku flatulencí je minoritní eliminační cestou, odstraňující přibližně 15–20 % vodíku vzniklého v lidském organizmu. Naopak exspirace je jedinou známou cestou eliminace absorbovaného vodíku z gastrointestinálního traktu a je takto eliminováno 30–40 % vzniklého vodíku (Christl, 1992). Rozvoj plynové chromatografie v 60. letech 20. století umožnil detekci nízkých koncentrací vodíku ve vydechovaném vzduchu v rozsahu 1–200 ppm (pars per milion) (Levitt, 1968). Studiemi bylo zjištěno, že koncentrace vodíku ve vydechovaném vzduchu jsou nižší u metan vydechujících osob ve srovnání s non exkretory metanu (metanoneproducenty) (Bjorneklett, 1982). Za fyziologických okolností je vodík v detekovatelných koncentracích přítomen ve splanchnických orgánech v rozsahu odpovídajícím portálnímu řečišti. Do těchto orgánů se dostává krevním transportem z tlustého střeva nebo přímou difuzí v břišní dutině. Jedná se především o orgány gastrointestinálního traktu a játra. Po opuštění jater je krev obohacená vodíkem kompletně očištěna již při svém prvním průchodu plícemi. To je způsobeno velice nízkou koncentrací vodíku ve vnější atmosféře. Bakteriální fermentace dietní vlákniny v tlustém střevě proto nemůže být využita jako zdroj vodíku pro periferní tkáně.
Závěr
Dietní vláknina je významná nutriční komponenta pro udržení správné funkce a obnovy kolonocytů ve střevní sliznici. Preventivní vliv na vznik řady civilizačních onemocnění tlustého střeva má především fermentace rozpustné dietní vlákniny v součinnosti s vlákninou nerozpustnou. Nutriční kvalitu dietní vlákniny lze zhodnotit metodou stanovení metanu či vodíku ve vydechovaném vzduchu. Touto metodou je hodnocena fermentovatelnost jednotlivých druhů vláknin in vivo, jak je prezentováno v tabulkách a obrázcích. Tento faktor je třeba vzít v úvahu při vytváření dietetických doporučení. Výše popsanými metodikami lze hodnotit fermentovatelnost jednotlivých druhů vláknin, čímž je oblast aplikací dechových testů dále rozšířena na hodnocení kvality nutričních doplňků.
RNDr. Mgr. Alena Tichá, Ph.D.
Centrum pro výzkum a vývoj, Fakultní nemocnice Hradec Králové
e-mail: alena.ticha@fnhk.cz
MUDr. Radomír Hyšpler, Ph.D.
Centrum pro výzkum a vývoj, Fakultní nemocnice Hradec Králové
prof. MUDr. Zdeněk Zadák, CSc.
Centrum pro výzkum a vývoj, Fakultní nemocnice Hradec Králové
LITERATURA
• Bjorneklett, A. & Jenssen, E. (1982). Relationships between hydrogen (H2) and methane (CH4) production in man. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 17, 985–992.
• Boone, D. R. (1985). Fermentation reactions of anaerobic digestion. In: Paul, N., Ouellette, R. P. (Ed.). Biotechnology applications and research. USA, Penn., Lancaster: Technomic Publishing Co.
• Dore, J., et al. (1995). Enumeration of H2-utilizing methanogenic archaea, acetogenic and sulfatereducing bacteria from human feces. FEMS Microbiology Ecology, 17, 279–284.
• Ermler, U., Grabarse, W., Shima, S., Goubeaud, M., & Thauer, R. K. (1997). Crystal structure of methyl-coenzyme M reductase: the key enzyme of biological methane formation. Science, 278, 1457.
• Fernandes, J., Rao, A. V., & Wolever, T. M. S. (2000). Different substrates and methane producing status affect short-chain fatty acid profiles produced by in vitro fermentation of human feces. Human Nutrition and Metabolism, 130, 1932–1936.
• Fernandes, J., Wolever, T. M. S., & Rao, A. V. (2000). Interrelationships between age, total dietary fiber intake and breath methane in humans. Nutrition Research, 20, 929.
• Gasparič, J., Hyšpler, R., & Tichá, A. (2004/5). Vydechovaný vzduch a poruchy metabolizmu - analýza těkavých látek v dechu. Vesmír, 83, 283.
• Hammer, H.F. (1993). Colonic hydrogen absorption: quantification of its effect on hydrogen accumulation caused by bacterial fermentation of carbohydrates. Gut, 34, 818–822.
• Christl, S. U., Murgatroyd, P. R., Gibson, G. R. (1992). Production, metabolism and excretion of hydrogen in the large intestine. Gastroenterology, 102, 1269–1277.
• Knudsen, B. K. E. (2001). The nutritional significance of dietary fibre analysis. Animal Feed Science and Technology, 90, 3–20.
• Kocna, P. (2006). Dechové testy – moderní, neinvazivní diagnostika. Interní Medicína, 2006, 7 a 8, 336–341.
• Levitt, M. D., Hirsh, P., Fetzer, C. A., Sheahan, M., & Levine, A. S. (1987). H2 excretion after ingestion of complex carbohydrates. Gastroenterology, 92, 383–389.
• Levitt, M. D., & Ingelfinger, F. J. (1968). Hydrogen and methane production in man. Annals of the New York Academy of Sciences, 150, 75–81.
• McKay, L. F., Eastwood, M. A., & Brydon, W. G. (1985). Methane excretion in man: A study of breath, flatus and faeces. Gut, 29, 69–74.
• Ruge, E. (1861). Beitrag zur kennuness der darmgase (German). Sitsber Kaiserlicken Akad, 44, 739.
• Rummney, C. J., & Rowlnad, I. R. (1992). In vivo and in vitro models of the human colonic flora. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 32, 4, 299–231.
• Segal, L., Walker, A. R. P., Lord, S., & Cummings, J. H. (1988). Breath methane and large bowel cancer risk in contrasting African populations. Gut, 29, 608–613.
• Steggerda, F. R. (1968). Gastrointestinal gas following food consumption. Annals of the New York Academy of Sciences, 150, 57–66.
• Šejblová, J. (1993). Stanovení obsahu hrubé vlákniny – obecná metoda - ČSN ISO 5498. Praha: Český normalizační institut.
• Tichá, A., Hyšpler, R., Zadák, Z., Indrová, M., Hyšplerová, L., Churáček, J., & Gasparič, J. (2003). Dietní vláknina a její vlivy na lidský organizmus. Klinická biochemie a metabolismus, 11(32), 27–31.
• Tichá, A., Hyšpler, R., Zadák, Z., Indrová, M., Hyšplerová, L., Churáček, J., & Gasparič, J. (2003). Nutriční a analytické hodnocení dietní vlákniny – stanovení methanu ve vydechovaném vzduchu. Klinická biochemie a metabolismus, 11(32), 32–36.
• Zadák, Z., Tichá, A., Hyšpler, R., & Jurašková, B. (2010). Význam dietní vlákniny ve stáří. Česká geriatrická revue, 8, 4.
